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固相萃取仪携带目的

捕鱼王时间:2020-04-18   浏览:129  

!基因技术#"! !!载体("#$%&’)是固相萃取仪捕鱼王携带目的 ()*片段进入受体细胞进行扩增和表达的工具。常用的载体有经过改造的 细菌质粒、噬菌体、黏粒和病毒。 ! !+-质粒 !!质粒(./01234)是细菌染色体外的双链环状的能自我复制的小 分子 ()*(图 +, +)。质粒对细菌本身的生长繁殖不是必需的, 但可以赋予细菌一定的表型,如抗药性等。质粒的性质中与载体 作用关系密切的包括: !!(+)质粒的复制型 !质粒的复制分为松弛型复制和严谨型复 制两类。严谨型复制质粒相对分子质量较大,质粒的复制需要蛋 白质合成和 ()*聚合酶 !,与细菌的复制密切相关,拷贝数只有 + 56个。松弛型复制质粒相对分子质量较小,复制过程需要 ()* 聚合酶 ",与细菌蛋白质的合成无关,拷贝数 +7 5877个。用氯霉 素抑制细菌蛋白质合成,细菌内质粒拷贝数可扩增到 + 777个以上。 !!(8)质粒的不相容性 !同一类群的不同质粒不能共存于同一 个菌株内的性质称为质粒的不相容性。质粒的不相容性决定于质 粒的复制子,复制子相同或相似的质粒不相容。现在基因工程中 使用的质粒都是经过人工改造过的,大多都带有一个来自于 9:;+ 质粒的复制子或与之亲缘关系十分接近的 <&/=+复制子。因此作 为载体的质粒一般是不相容的。 !!(>)质粒的接合性 !有些质粒在自然界内可以从一个细菌传递到另一个细菌,如某些抗药性质粒。 这些质粒称为接合性质粒或传递性质粒。接合性质粒上都有接合基因,接合基因的相对分子质量大约为 8 ?+7,,因此接合性质粒的相对分子质量都很大。缺少接合基因不能在自然界自由传递的质粒则叫作非 接合性质粒。用作载体的质粒都是非接

 

合性质粒。 !!(@)多克隆位点 !即多种限制性内切酶的单一识别序列,作为外源基因的插入位点。 !!(6)筛选标记 !常用的筛选标记有双抗生素抗性插入失活筛选标记和蓝白菌落筛选标记。 .;A>88 是常用的载体质粒,它有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基 因。抗四环素基因中有 !"#B"和 $"%"酶的单一切点,在 这些切点中插入外源基因的细菌抗氨苄青霉素而对四环素 敏感;抗氨苄青霉素基因内有 &’("酶切位点,此点插入外源 基因的细菌抗四环素而对氨苄青霉素敏感(图 +, 8)。 .C<系列等质粒上有氨苄青霉素抗性基因和 )"*+基因片 段, )"*+基因片段编码 !半乳糖苷酶的氨基端片段。此片 段能与宿主细胞所编码的缺陷型 !半乳糖苷酶基因内互 补,形成完整的 !半乳糖苷酶。此酶分解 6溴 @氯 > 吲哚 ! (半乳糖苷( D E0/),产生蓝色菌落。 )"*+基 因片段内有多克隆位点,插入外源基因后不能合成完整的 ! 半乳糖苷酶来分解 D E0/,产生白色菌落。 ! !8-"噬菌体 !! "噬菌体( F0$%#’3&.G0E#,.G0E#)是线性双链 ()*,全长 @H IF,两端各有 +8个碱基的单链突出端,是天然的黏性末 端,称为 $&1区。此 $&1区在感染细菌后借黏性末端连接而 使噬菌体 ()*环化,在细菌内大量繁殖。噬菌体 ()*的中间部分约占全基因组的 >7J,与溶源性生长方 式有关。此区域的缺乏或被取代,对噬菌体裂解型生长方式都没有严重的影响,可作为外源

 

 ()*片段的 图 +, +!质粒电镜图 图 +, 8! .;A>88质粒 #"!第三篇 *遗传信息的传递 克隆部位。噬菌体外壳蛋白包装 !"#时,要求重组 !"#分子的大小是野生型基因组全长的 $%& ’ ()%&。这意味着噬菌体在包装时对重组的外源 !"#长度进行了一次筛选,分子过大或过小的外源 !"# 都不能被包装入噬菌体。 * *+,黏粒 **黏粒(-./012)是由 !噬菌体的 -./区与 345+66组合的杂种载体。 345+66提供复制起始点,酶切位 点,抗生素抗性基因,而 -./区提供黏粒重组外源 !"#大片段后的包装基础。黏粒可克隆 67 89’:%89 的大片段,常用作建立真核基因组文库的载体。 * *:,病毒 **病毒载体更多用于真核表达系统,如腺病毒、腺病毒相关病毒、痘病毒、逆转录病毒、猴空泡病毒等。 二、基因工程的操作过程 **基因工程操作过程概括起来包括:目的基因的获得,目的基因与载体的连接,重组 !"#分子导入受体 细胞,基因工程菌的筛选与鉴定,目的基因的表达和表达产物的纯化(图 ($ +)。 图 ($ +*基因工程的流程图

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