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固相萃取装置基因组中的基因

时间:2020-04-18   浏览:145  

**(一)目的基因的获得 **对固相萃取装置基因组中的基因进行研究和应用必须先获得该基因。这种供研究和应用的基因称作目的基因。基 因工程操作中获得目的基因的方法大体有如下几种: * *(,从生物细胞中直接提取 **低等动物的基因组相对比较简单,大多数基因已经定位,基因间没有间隔序列,因此适合用从细胞内 直接提取的方法获得目的 !"#。 **从生物体内直接提取 !"#可先用探针将目的基因钓出再重组,也可以先将 !"#酶切重组后再在重 组菌中筛选有目的基因的基因工程菌。 **基因组文库(;<=.01->19?@?A):将某种生物的基因组 !"#切割成一定大小的片段,分别与适合的载体 重组后导入宿主细胞,这些重组分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列。这种通过重组、克 隆方法保存在宿主细胞中的各种 !"#重组分子的集合体叫作基因组文库。 第十七章 !基因技术#"! ! !"#合成 $%&’ !!真核生物基因比较复杂,一般都有间隔顺序即内含子,需要进行转录后的加工。原核细胞缺少转录后 加工系统,真核基因转录的 ()*&’不能在原核细胞内剪接成成熟的 +*&’。欲将真核基因送入大肠杆 菌中去表达,一般都采用 $%&’的方法获得目的基因。即先提取 +*&’,用逆转录酶将其逆转录成 $%&’, 以去除内含子序列,再进行 $%&’的克隆和表达。 ! ! $%&’文库($%&’ ,-./0/1):从真核细胞中分离纯化出所有的 +*&’,再以这些 +*&’为模板合成其 相应的 $%&’,与适当的载体重组转入宿主细胞。这样建立起的 $%&’重组分子的集合体叫作 $%&’文 库。 $%&’文库中插入片段的总和可代表某一种生物全部的 +*&’序列。 ! !2#人工合成 !!编码某些活性多肽的基因只有十几或几十个核苷酸,只要知道这些多肽的氨基酸顺序或其基因的核 苷酸顺序,人工合成这些基因不仅在理论上是行得通的,在实际操作上也十分方便。 !!对于较大

 

的基因直接合成比较困难,可将 %&’的两条链分成几个片段分别合成,再按碱基互补形成 有切口的双链,用 %&’连接酶连接成完整的双链。 ! !3#聚合酶链反应扩增基因 !!有些基因在细胞内的数量很少,提取困难。只要知道基因两端的部分核苷酸顺序,即可按着碱基互补 的原则,合成引物,用聚合酶链反应扩增基因。 !!(二)目的基因与载体的连接 !!目的基因与载体的连接是基因工程操作中的重要环节,选择什么样的连接方式连接目的基因和载体, 要根据限制酶切割目的基因和载体后的断端确定。 ! !4#同源黏性末端连接和平端连接 !!目的基因和载体上有相同酶或同尾酶的酶切位点,酶切后产生同源黏性末端,可用同源黏性末端连 接。若目的基因和载体都能被某些产生平端的限制酶切割,可用平端连接目的基因和载体。 ! !"#定向连接 !!定向连接是将目的基因定向插入载体。通常是用两个不同的限制酶同时切割目的基因和载体,在目 的基因和载体上产生两种不同的黏性末端,或者一个黏端,一个平端,从而限制目的基因的插入方向(见 图 45 3)。 图 45 3!目的基因与载体的各种连接方式 !!当目的基因和载体之间没有相同的酶切位点不能产生相同的酶切末端时,可以设计合成一段的双 链 %&’,一端碱基与酶切后的目的基因末端同源,另一端与酶切后的载体末端同源,作为桥梁把目的基因 和载体连接起来。 !!(三)重组体导入受体细胞 !!受体细胞也称宿主细胞,是重组子扩增和表达的场所,分原核和真核两类。原核细胞主要是指大肠 杆菌。 !!以质粒为载体把外源基因转入细菌称为转化( 6/0)789/+06-9)),以噬菌体和病毒为载体导入细胞称为 #"!第三篇 -遗传信息的传递 转染(!"#$%&’(!)*$),有人又把以噬菌体为载体将外源基因导入细菌称为转导(!"#$%+,(!)*$)。 --不经处理的细菌很难转化,只有经过敏感处理的


细胞才有较高的转化率,这种细胞称为感受态细胞 ((*。/’!’$(’ (’00)。诱导感受态细胞一般用化学方法,即用冷的氯化钙处理细菌。细菌在 12的氯化钙低 渗溶液中膨胀成球形,细菌的细胞壁和膜的通透性增强。外源 345与钙离子形成复合物,黏附在细菌表 面,经 67 2热处理促进细胞吸收。细菌细胞在数小时培养后恢复原形并进行分裂繁殖。 --另一种常用的转化方法是电击法,即用短暂的高压电脉冲使 345进入细菌。电击法不需要制备感受 态细胞。当电场强度、电脉冲幅度和脉冲次数等组合合适,细菌的死亡率达 819 : ;89时有较高的转 化率。 --以 !噬菌体和黏粒为载体的重组 345导入大肠杆菌需体外包装,即在试管内将重组 345和 !噬菌 体的头部和尾部蛋白混合,包装成完整的噬菌体感染大肠杆菌。 --(四)基因工程菌的筛选 --转化的细菌涂布在含有抗生素的平皿上,长成单个菌落。这些菌落有的转入了自身环化的质粒,有的 转入了重组质粒。重组质粒仅表示质粒上插入了外源基因,这些外源基因不一定就是目的基因。基因工 程菌的筛选(%("’’$)$<)和鉴定( )+’$!)&)(#!)*$)即是在这些菌落中筛选出含有目的基因的菌落,并鉴定其正 确性。 --345重组体和质粒自身环化的鉴别:带有双抗生素标记的质粒自身环化在两种抗生素培养基上都能 生长, 345重组体只能在其中一种抗生素培养基上生长。带有 =#(>基因的质粒自身环化在 ? <#0培养 基上经异丙基硫代半乳糖苷( )%*/"*/@0 !A)*<#0#(!*%)+’,BCDE)诱导生成蓝色的菌落, 345重组体长成白色 的菌落。 --基因工程菌的筛选一般选用菌落或噬菌斑原位杂交方法( (*0*$@ G /0#H,’ )$ %)!, A@I")+)J#!)*$)。首先将在琼脂平板上生长的重组菌落或 噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上,以 4#KL裂解菌落,并使 345变性,固 定到膜上,用特异的 345或 M45探针与之进行分子杂交。挑选含有 目的基因的克隆菌(图 F; 8)。 --外源基因获得表达的基因工程菌也可以用免疫学的方法筛选

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